随着现代科学技术的不断发展、社会的日益进步，遗传代谢相关性疾病体外检测诊断技术应用越来越普遍，检测的形式和方法趋于多样性。遗传代谢病是一大类临床症状复杂的疑难杂症，其临床检测方法除了常规的生化病理等手段外，目前临床还采用代谢物分析、基因分析和酶活性(蛋白质功能)分析这三种技术。这些新的体外检测技术相互结合应用，为新的疾病检测方法研发提供了更多的选择。现结合临床和科研中的大量实践，对这三种诊断方法的特点及临床应用进行分析、比较和归纳，以期为临床工作者更好地运用这三种技术方法提供一些经验参考。

1　遗传代谢病概述

遗传代谢病是因维持机体正常代谢的某种酶、载体蛋白、膜或受体等的编码基因发生突变，使其编码的产物功能发生改变，从而导致机体生化代谢紊乱，造成中间或旁路代谢产物蓄积，或终末代谢产物缺乏，引起一系列临床症状的一组疾病。

从定义就可以发现，遗传代谢病的三大本质规律：

①遗传代谢病的起因是基因发生了问题；

②基因不直接参与新陈代谢，由它编码的蛋白来发挥功能，某个基因出现问题导致其编码的的蛋白合成出现障碍，从而无法执行特定的功能；

③基因突变和蛋白功能障碍都是引起症状的上游原因，引起症状的最直接原因不是基因突变，也不是蛋白合成障碍，而是代谢物的堆积或者缺乏。

正是基于遗传代谢病的发病机制和以上特点，遗传代谢病的诊断一直是临床上一大难点。随着生物学技术的飞速发展和应用，遗传代谢病的检测方法也由早期的代谢物分析，发展到酶学(蛋白质功能)分析和基因分析。这三种方法各有特点，从长远发展来看，三者应相互结合使用，形成对遗传代谢病诊断的系统解决方案。而具体到每一种病种或每一个例时，又需要因病制宜，因人而异，灵活运用。总体来说，根据病史和症状特点由简而繁、由初筛至精确、按一定的步骤选择不同的方法进行检测诊断。例如，苯丙氨酸羟化酶缺乏所致的苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)的诊断，目前的技术虽不能直接检测苯丙氨酸羟化酶的活性，但可以通过串联质谱(MS/MS)和气相色谱(GC/MS)方法检测血和尿中的代谢物(苯丙氨酸、苯丙酮酸、苯乙酸等)，对阳性患者再行PAH基因突变检测，最终达到明确诊断。有机酸、氨基酸代谢病如甲基丙二酸尿症、戊二酸血症等大都采用类似的检测诊断流程。而另一大类遗传代谢病溶酶体贮积病的确诊，则是直接检测血浆、外周血白细胞或培养的皮肤成纤维细胞内相应的溶酶体酶活性，然后进行致病基因突变检测。

2　三种检测技术的发展现状

代谢物分析是最早应用到遗传代谢病检测诊断领域的。目前临床上代谢物的分析检测方法很多，包括血、尿常规生化分析和筛查，氨基酸定性或定量分析，有机酸、酰基肉碱、酰基甘氨酸分析，长链脂肪酸分析，嘌呤、嘧啶分析，碳水化合物、糖醇分析，寡糖、黏多糖分析等等。比较常用于遗传代谢病检测的方法有：色谱质谱联用包括气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱质谱联用(LC-MS)，GC/MS与LC/MS互为补充，分析不同性质的化合物等，这些方法往往可同时检测几十种甚至上百种代谢物，可以对患者进行初步的筛查，以观察其体内是否存在可能的代谢途径障碍，涉及的疾病种类包括氨基酸代谢疾病、有机酸代谢疾病及脂肪酸代谢疾病等。

近十几年来，随着分子生物学及基因组学等生物科学和技术的快速发展，基因分析也逐步引入到遗传代谢病的检测诊断领域，并取得长足的发展。除了最基础也是应用最广泛的基因DNA序列分析(即一般说的一代测序技术)外，还有基因表达水平、表观遗传等方面的诊断方法，如mRNA表达水平分析、DNA甲基化检测、非编码RNA分析等。值得一提的是，近几年推出的高通量基因测序(即二代测序)技术，对于一些遗传异质性较强的疾病来说，显然是有一定的成本和时间优势。

相比以上两种检测方法，酶学检测方法的发展相对滞后。虽然约30年前就开始有些酶学检测方法用于遗传代谢病的诊断(如一些溶酶体病)，但从开发的检测方法数量和针对的病种而言，显然是严重落后的。目前常见的也就是针对一些溶酶体病、生物素酶缺乏症、蚕豆病等的酶活性检测，近些年推出的白细胞线粒体氧化磷酸化复合物酶学检测也开始得到临床的重视和应用。

3　各检测方法的特点

3.1　代谢物检测

从技术原理和发展水平看，代谢物筛查方法具有以下特点：

①可实现从单个样品中同时检测多种代谢产物，获得的信息量较大，但同时也造成结果分析难度高、数据解读困难，需要具有深厚的生物化学理论基础才能很好的解读检测结果；

②检测结果容易受药物及饮食的影响，如抗惊厥药丙戊酸钠可干扰一些酰基肉碱的检测，因此基于软件分析的数据结果往往不可靠，需要有丰富经验的专业人士进行数据分析和解读；

③不能用于检测同分异构体，如单独分析亮氨酸、异亮氨酸及羟脯氨酸；

④由于人体的代谢途径是一极其复杂的网络，很多代谢途径都相互交叉，实际应用中大部分代谢产物的检测专一性不高，不同疾病可能会产生相同的代谢产物，一种疾病也会引起很多代谢物的异常，因此，代谢物分析提供的是可能的代谢途径障碍，而一般无法明确该代谢途径中的具体哪个步骤或者哪个酶出问题，因此也就难以直接确诊；

⑤遗传代谢病的直接病因就是代谢物的蓄积，如果患者有临床症状表现，就说明体内一定存在代谢物水平的变化，那么，在这种情况下，对代谢物的筛查是很有必要的。因此，代谢物的筛查方法更适合对有症状的患者进行辅助诊断。

需要特别注意的是，对于那些新生儿或者尚无明显症状的个体来说，代谢物筛查有一定缺陷。由于在新生儿期还没有足够的物质摄入，很多代谢途径并不旺盛，即使存在某种遗传代谢缺陷(即基因缺陷)，其相关的代谢物也不一定会堆积或无明显堆积，所以在新生儿期的代谢物水平也很可能无明显升高。这可以解释为什么患同一种遗传代谢病，发病年龄差别会很大(如生物素酶缺乏症患者的发病年龄从几个月到15岁)，虽然有酶活力缺失程度的差异，但生活环境和习惯造成的代谢途径的不同步应是其中的主要因素。如果这时候进行代谢物筛查，有可能会出现假阴性的结果(如PKU的新生儿筛查结果阴性者，有日后发病的；戊二酸血症I型同样如此)，新生儿筛查的目的是把阳性尽可能全筛出来，如果是假阴性的结果，对于患儿及其家庭造成的后果是非常可怕的，将会严重影响对疾病的早期干预和治疗。相反，假阳性的结果一般来说后果是相对可以承受的，因为它可以通过后续的二次检查来排除。

3.2　基因分析

基因水平的遗传病诊断也就是基因诊断(gene diagnosis，又称为DNA诊断)是20世纪70年代在重组DNA技术基础上迅速发展起来的一项应用技术，旨在对患者或受检者的某一特定基因或其转录产物进行分析和检测，从而对相应的遗传病进行诊断。

由于得到一个能正常发挥功能的蛋白或蛋白复合物(以酶或酶复合物为典型代表)所涉及的步骤很多，从DNA转录到翻译到折叠到修饰再到正确的投递等等，此外，还可能涉及其他辅因子、辅基、辅酶甚至分子伴侣等，这些步骤都需要许多由基因调控序列或者其他基因编码的蛋白参与，因此一个酶的功能的正确发挥，实际涉及的基因远不止编码这个酶本身的基因。而且近些年越来越多的研究表明，遗传病的发生不仅与基因(DNA)的结构有关，还与转录水平或翻译水平上的变化有关。当然目前用于遗传代谢病的检测主要还是基因测序分析。

基因测序分析具有以下优点：

①影响因素小，可以直接对致病基因进行检测；

②专一性高，如果检出已明确的致病突变，可对疾病进行确诊；③可检测的病种全，几乎可以涵盖已经发现和明确的各种遗传代谢病。

但基因检测方法的缺点也很明显：

①如果检测出未报道的新突变，其是否具有致病性不明确，必须进行功能验证；

②目前基因测序分析

主要是对外显子(即编码区序列)，内含子和调控序列信息如果有缺陷就会被遗漏，因此，基因检测并不是十分全面的；

③对于检出的基因突变，如果没有对蛋白质功能影响方面的研究，也无法了解其对蛋白质功能的影响程度，临床上也就无法预测其致病的严重程度；

④由于科学研究的局限性，很多疾病相关的致病基因以及致病突变尚未被全面揭示。

因此，在解读检测报告时要十分谨慎，必须请临床遗传学专家解读报告。虽然基因检测未必能全面发现致病的突变，但对于遗传性疾病来说，基因诊断是确诊这类疾病的重要依据之一。而且，基因检测能够了解遗传信息，可以帮助患者明确基因缺陷，从而对病因进行分析，并针对该基因或位点对家族成员携带状态进行筛查，明确该疾病的遗传方式，对遗传咨询和再生育起指导性作用。

3.3　酶学分析

酶学(蛋白质功能)检测是对酶的功能进行评估的一种方法。酶是生物体内产生的一种具有催化功能的有机物，多数是蛋白质。酶的催化具有高效性和专一性等特点，因此在特定的条件下用该酶的专一性底物进行酶活性的检测即可判断酶的功能是否正常，通常所说的酶学检测是指酶学活性检测也称为酶活力分析。

酶学检测的优点：

①是直接对蛋白质功能检测，特异性及灵敏度较高，如溶酶体病，每一种病都是由特定的酶活性缺乏导致的，检测出某种酶缺陷，就可以直接判断是哪一种疾病；

②酶学检测不受患者年龄的影响，如果先天有酶活性的缺陷，新生儿期即可检出，并且可根据其缺陷水平预测其患病的严重程度，为临床治疗提供指导；

③酶学检测可以很好的回避基因检测的局限性，由于是针对功能的检测，那么无论是编码这个酶本身的基因缺陷，还是在这个酶从翻译、转录、修饰、投递到正确折叠发挥功能的各个阶段的任何相关基因缺陷，都会导致酶的功能失常，从而被检测出来，这对于疾病的确诊已经是充分的条件了。基于以上特点，酶学检测可用于疾病的最终确诊和疾病筛查。

但是酶学检测技术要求较高、难度大，对样本采集、运输及保存等外部环境要求严格；而且有些蛋白并不都在易于采集的白细胞等组织中表达，导致检测标本取材难度大；酶学检测中蛋白用量大及蛋白所处环境的干扰等因素的限制，因此，目前可检测的疾病种类相对较少，仍需进一步开发。此外，需要注意的是，酶学检测是一种临床检测，它有严格的质控等要求，这种从生物学技术转化为临床检测技术有很多的难题需要跨越，这也是限制临床酶学检测项目发展的一个重要因素。当然从未来的发展趋势看，酶学检测必然会在遗传代谢病的诊断中发挥越来越关键的作用。而且随着生物技术的发展，适用于临床检测的酶活力分析项目也会越来越多。

4　三种检测方法的综合对比及应用建议

4.1　检测方法特点总结

从是否受发病情况限制的角度分析，代谢物的检测结果受发病情况的限制，而酶学检测和基因检测不受发病情况限制，如果受检者存在技术检测范围内的先天遗传代谢缺陷，任何时间段都可以检出，无论是新生儿期还是发病期；从特异性角度分析，代谢物的检测特异性低，结果分析复杂，不容易对疾病作出明确诊断，基因检测特异性相对较高，如果发现明确致病突变，就可以确诊疾病，但也有些发现的是未报道的新突变，其致病性就是很难确定；另外也由于文中所阐述的基因检测的局限性，所以遗传代谢病的病因诊断也不能完全依靠基因检测来解决。酶学检测特异性高，酶活性缺陷就意味着相关的代谢途径出现异常，根据酶活性的正常与否就可以判断受检者是否患有相应的疾病，结果直观，容易判断，准确度高；但前提是检测的方法准确，结果可靠。

4.2　应用建议

从临床应用角度，建议针对不同情况可以采用不同的检测方法，必要时可以几种方法并用，逐步查找出病因。

①对临床出现症状的患者，怀疑是遗传代谢病时，如果不能确定疾病类型，可以先选择代谢物的筛查，初步了解可能存在的遗传缺陷，再结合临床症状及其他检查缩小范围，如果针对所怀疑的生化缺陷可以进行功能检测，也就是指酶学检测，则选择先做酶学检测，然后再根据酶学检测结果，针对性的检测相关基因，找出致病突变；

②对于新生儿疾病的筛查，酶学检测是最为科学的方法，但由于受技术难度的限制，目前可检测的种类还较少，而代谢物的检测用于新生儿遗传代谢病的筛查时，应清醒地正视其存在的问题，努力将此方法更多地应用于有症状患者的辅助诊断，发挥方法本身的优势，避免其不足。总之，在工作中要充分认识三种方法的不同特点，恰当、灵活地运用三种方法，扬长避短，使三者有机结合，科学、正确地应用于遗传代谢病的诊断。